Das Spiel handelt von dem Eulenjungen Otus der zu einer humanoiden Eulenrasse gehört. Der Spieler kontrolliert Otus und kann die Welt hauptsächlich durch fliegen erkunden. Die Welt von Owlboy befindet sich in der Luft und ist von fliegenden Inseln umgeben. Eines Tages wird das Heimatdorf von Flugpiraten angegriffen wodurch sich Otus mit Hilfe seiner Freunde auf den Weg macht diese aufzuhalten und mehr über seine eigene Rasse zu erfahren.

Das Gameplay beinhaltet das typische erkunden und sprechen mit verschiedenen NPC's. Was Owlboy aber besonders macht ist dass Otus mit Hilfe seiner Gefährten Gegner angreifen kann indem er diese trägt und mit dessen Schusswaffen verschiedene Angriffe abfeuern kann. Otus alleine besitzt lediglich einen kurzen Wirbelangriff der Gegner für kurze Zeit ausser Gefecht setzt.

Owlboy ist eine Mischung aus 8-bit und modernen Klängen. Bei der Hintergrundmusik fällt dies besonders auf. Die Stimmung der Musik verändert sich je nach Ereignis und kann abenteuerlich, friedlich, heroisch oder bedrohlich sein.