Das Spiel handelt von dem Eulenjungen Otus der zu einer humanoiden Eulenrasse gehört. Der Spieler kontrolliert Otus und kann die Welt hauptsächlich durch fliegen erkunden. Die Welt von Owlboy befindet sich in der Luft und ist von fliegenden Inseln umgeben. Eines Tages wird das Heimatdorf von Flugpiraten angegriffen wodurch sich Otus mit Hilfe seiner Freunde auf den Weg macht diese aufzuhalten und mehr über seine eigene Rasse zu erfahren.

Das Gameplay beinhaltet das typische erkunden und sprechen mit verschiedenen NPC's. Was Owlboy aber besonders macht ist dass Otus mit Hilfe seiner Gefährten Gegner angreifen kann indem er sie trägt und mit dessen Schusswaffen verschiedene Angriffe abfeuern kann. Otus alleine besitzt lediglich einen kurzen Wirbelangriff der Gegner für kurze Zeit ausser Gefecht setzen und Objekte zerstören kann.

Owlboy ist eine Mischung aus 8-bit und orchestralischen Klängen. Bei der Hintergrundmusik fällt dies besonders auf. Die Stimmung der Musik verändert sich je nach Ereignis und kann abenteuerlich, friedlich, mysteriös, heroisch oder bedrohlich sein.

Das Spiel verwendet als Ambient Sounds hauptsächlich die Elemente von Wind und Erde. Windgeräusche werden zum Beispiel dann abgespielt wenn der Spieler durch einen Tunnel in einen Dungeon gelangt und Erdgeräusche innerhalb der Dungeons.

Die meisten NPC's in Owlboy haben eine eigene Soundspur im Dialogfenster. Es wird der selbe Soundclip verwendet aber leicht im Pitch verändert oder ein Instrument darübergelegt damit es verschieden klingt. Der Sound Feedback während des kämpfens wird durch dumpfe 8-bit artige explosions- und schuss Klänge klar kommuniziert. Das Treffen und zerstören eines Gegners wird dadurch sehr befriedigend.

Die Soundeffekte von Otus sind eine Mischung aus 8-bit Sounds und realen Audio Aufnahmen.